Imagerie in vivo du transport du liquide céphalo-rachidien dans le cerveau d’une souris à l’aide de la macroscopie à fluorescence

Résumé

Source : Sweeney, A. M., et al. Imagerie in vivo du transport du liquide céphalo-rachidien à travers le crâne de souris intact à l’aide de la macroscopie à fluorescence. (2019)

Cette vidéo démontre le processus de visualisation de l’écoulement du liquide céphalo-rachidien (LCR) dans le cerveau d’une souris à l’aide de l’imagerie par fluorescence. Un traceur fluorescent est injecté dans la citerne géante (CM), ce qui permet de suivre son mouvement avec le LCR à travers les espaces sous-arachnoïdien et périvasculaire. L’imagerie en accéléré capture le parcours du traceur, mettant en évidence sa distribution dans le tissu cérébral via les artérioles.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la canule de la citerne magna, de la plaque de tête et du support de tête

1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux et les plaques de tête avant l’opération.
   REMARQUE : Les traceurs fluorescents sont administrés directement dans le LCR par l’intermédiaire d’une canulation de citerne magna.
2. Brièvement, à l’aide d’un tourne-aiguille, cassez la pointe d’une aiguille de 30G x 12,7 mm (1/2 pouce), aux 3/4 de la profondeur, et placez l’extrémité émoussée de l’aiguille dans une extrémité d’un tube en polyéthylène 10 (PE10) (environ 45 cm de long). Assurez-vous que seul le biseau dépasse du bord du tube PE10.
3. Cassez 1/4 de l’extrémité biseautée d’une autre aiguille 30G et placez l’extrémité émoussée de l’aiguille restante dans l’autre extrémité du tube PE10, avec le Luer-lock en plastique toujours attaché.
4. Remplissez une seringue en verre de 100 μL avec du LCR artificiel stérile (aCSF : 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM de glucose et 26 mM de NaHCO₃).
5. Fixez la seringue à l’extrémité de la ligne et remplissez-la d’aCSF jusqu’à ce qu’elle atteigne la pointe de l’aiguille biseautée. Il est important que la seringue soit remplie d’aCSF et non d’air, car une colonne d’air est plus sujette à des volumes de perfusion variables.
6. Pour les expériences chroniques, laissez la ligne remplie d’aCSF et sautez l’étape 1.7.
7. Pour les expériences aiguës, placez la seringue sur une pompe à perfusion et prélevez environ 5 mm d’air, ce qui empêchera le mélange. Ensuite, prélevez le volume total de traceur(s) souhaité(s) pour l’expérience (20 % supplémentaires sont recommandés en raison des pertes d’espace mort).
   REMARQUE : Le tube PE10 doit être suffisamment long pour que la bulle d’air ne pénètre pas dans le brassard en plastique de la seringue en verre lors du chargement du traceur. Pour une expérience typique, le protocole utilise 10 μL d’albumine sérique bovine conjuguée à Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluée dans un LCR à 0,5 %.
8. Vérifiez que la plaque de tête s’insère dans le support de tête et qu’elle est de la bonne taille pour la souris utilisée. Les repères anatomiques pour s’en assurer sont les suivants : le bord supérieur de la fenêtre s’aligne avec la ligne interoculaire et le bord postérieur tombe rostralement à la crête occipitale.
   REMARQUE : Les plaques de tête en acier inoxydable peuvent être stérilisées et réutilisées. La plupart des mélanges de cyanoacrylate peuvent être éliminés avec une solution d’acétone.

2. Intervention chirurgicale

1. Pesez et anesthésiez la souris (p. ex. kétamine/xylazine ; 100 mg/kg de kétamine, 10 mg/kg de xylazine ; i.p.).
2. Une fois que la souris ne répond plus à un pincement d’orteil, humidifiez le cou et la tête avec de l’eau stérile et rasez-vous à l’aide d’une tondeuse. Une fois la zone rasée, essuyez-la à nouveau avec un tampon imbibé d’alcool pour éliminer tout poil résiduel.
   REMARQUE : Humidifier la fourrure avant de tondre réduit considérablement la quantité de poils dans la fenêtre d’imagerie après l’incision.
3. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique sur un tampon à température contrôlée et appliquez une pommade ophtalmique à base de pétrole sur les yeux de la souris pour vous assurer qu’ils ne se dessèchent pas.
4. Nettoyez la peau exposée à l’aide d’un tampon de chlorhexidine. Après 2 min, retirez la chlorhexidine avec une lingette imbibée d’alcool. Enfin, appliquez une solution iodée que l’on peut laisser sécher.
5. Injectez une analgésie sous-cutanée (0,25 % de bupivacaïne HCl) sur le haut du crâne et le cou.
6. En commençant par la partie du cou qui recouvre la crête occipitale, faites une coupe médiane dans la peau sus-jacente et continuez rostralement vers la ligne interorbitaire. Inciser latéralement jusqu’au bord où le muscle temporal s’insère dans le crâne. Retirez toute la peau de l’incision fusiforme pour exposer les os frontaux et pariétaux.
   ATTENTION : Le sinus rétroorbitaire se trouve caudalement par rapport aux yeux et les grandes branches de la veine faciale postérieure se trouvent rostrale au pavillon. Soyez prudent lorsque vous faites l’incision pour épargner ces structures. Si cela se produit, arrêtez le saignement en maintenant l’hémostase avec un coton-tige stérile pendant plusieurs minutes et continuez.
7. Irriguez le crâne avec une solution saline stérile et nettoyez la surface à l’aide de cotons-tiges afin qu’elle soit exempte de débris et de cheveux, car ceux-ci interféreront avec la qualité de l’image. La meilleure façon de préserver la transparence du crâne est de laisser intacts le périoste et le fascia sus-jacent.
   REMARQUE : Si ces structures sont accidentellement enlevées, le crâne peut devenir sec et opaque avec le temps. Réhumidifiez avec de l’aCSF ou utilisez un mélange d’huile de paraffine et de glycérol pour réduire la réflectance du crâne dans les expériences aiguës.
8. Procédez à l’insertion de la canule de la citerne magna.
9. Après avoir inséré la canule CM, appliquez un mélange de ciment dentaire avec de la colle cyanoacrylate sur la face ventrale de la plaque de tête autour du bord et placez-le sur le crâne de sorte que le bord antérieur de la plaque de tête s’aligne avec l’extrémité postérieure de l’os nasal et que le bord postérieur s’aligne avec la face antérieure de l’os interpariétal, en s’assurant que la suture sagittale (ligne médiane) est centrée et droite par rapport à la fenêtre (Figure 1B).
10. Fixez la position de la plaque de tête à l’aide de quelques gouttes d’accélérateur de colle. Remplissez les espaces restants avec le mélange de ciment et faites-le durcir avec accelerator.
    ATTENTION : Assurez-vous que le cyanoacrylate n’entre pas en contact avec les yeux de la souris ou ne bloque pas la fenêtre d’imagerie.
11. Collez la canule CM sur la plaque de tête pour vous assurer que celle-ci ne se détache pas pendant le transport ou lorsque la souris se réveille.
12. Pour les expériences aiguës, passez à l’étape 2.16.
13. Pour les expériences chroniques, appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate à séchage transparent sur le crâne exposé, en faisant attention de ne pas créer de bulles car celles-ci interféreront avec l’imagerie. La colle protège le crâne et n’interfère pas avec l’imagerie. Assurez-vous que la colle recouvre le crâne exposé jusqu’à la peau au bord de l’incision.
14. À l’aide d’une pince hémostatique, maintenez le tube PE10 rempli d’aCSF à 2-3 cm du CM et coupez la ligne avec une pointe de cautérisation à haute température. Une fois qu’il est séparé, aplatissez le tube PE10 fondu pour sceller la canule.
    ATTENTION : Assurez-vous de ne pas relâcher la pince avant que la canule n’ait été scellée et confirmez qu’il n’y a pas de fuites dans le tube pour éviter une fistule du LCR.
15. Administrer du carprofène (5 mg/kg toutes les 24 h pendant 3 jours ; intrapéritonéale [i.p.] ou sous-cutanée [s.c.]) et remettre la souris dans une cage à température contrôlée et à logement unique et lui permettre de récupérer pendant au moins 24 h avant l’imagerie. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle retrouve une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Les fenêtres crâniennes intactes restent stables pendant plusieurs semaines. REMARQUE : L’expérience chronique peut être interrompue ici.
    ATTENTION : Certaines complications postopératoires sont : céphalohatomome/hématomes sous-galéaux, fistule du LCR et infection.
16. Pour les expériences aiguës, placez la souris dans le support de tête à l’aide de la plaque de tête de sorte que le crâne soit dans une position fixe. Assurez-vous de vérifier le niveau d’anesthésie et de placer un coussin chauffant sous la souris. La souris est maintenant prête à être emmenée vers le macroscope.
    ATTENTION : Transportez soigneusement la souris avec la pompe à perfusion sur un chariot. Si la canulation CM se déloge, cela provoquera une baisse de la pression intracrânienne et toute fuite de LCR modifiera les résultats expérimentaux.

3. Préparation de la souris pour l’imagerie

REMARQUE : Le protocole varie selon que l’expérience d’imagerie sera réalisée sur une souris anesthésiée (à partir de l’étape 3.1) ou éveillée (à partir de l’étape 3.2).

1. Souris anesthésiées
   1. Placez le support de tête sur la platine du macroscope, en vous assurant qu’il n’y a pas de plis dans la conduite entre le pousse-seringue et la canule CM et qu’elle n’est pas tendue car cela pourrait affecter la perfusion de traceur.
   2. Observer la fréquence respiratoire et la coloration rose des muqueuses, indiquant une bonne oxygénation. Injectez une solution saline par voie sous-cutanée pour garantir le niveau d’hydratation si nécessaire. Assurez-vous que l’animal est suffisamment anesthésié et redosez-le si nécessaire.
   3. Allumez la caméra macroscope et la diode électroluminescente (LED) et démarrez le mode LIVE.
   4. Confirmez le grossissement du champ d’imagerie de sorte que la suture nasofrontale en haut du champ et la suture lambdoïde en bas puissent être clairement visualisées, avec la suture sagittale parallèle et centrée au milieu de l’image (Figure 1C). Une fois en place, fixez le support de tête à la platine du macroscope avec du ruban adhésif.
   5. Concentrez le macroscope sur le crâne exposé. Bien que les macroscopes aient une profondeur de champ relativement grande, la courbure du crâne de la souris ne permet de faire la mise au point que sur une zone spécifique. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le plan focal est situé sur les côtés latéraux des os pariétaux postérieurs aux sutures coronales.
      REMARQUE : Il s’agit de l’emplacement des artères cérébrales moyennes (ACM), où se produit la plupart des afflux de LCR (Figure 1D, E).
2. Réveillez-vous les souris
   1. Avant la séance d’imagerie, laissez les animaux récupérer pendant au moins 24 h après l’opération de la plaque de tête. Des périodes de récupération plus longues (5 à 7 jours) sont également recommandées. Pendant ce temps, entraînez la souris à être fixée la tête sur la platine dans le tube de contention pendant 0,5 à 1 h par jour pendant toute la durée de la période de récupération.
      REMARQUE : L’habituation permet à la souris d’être attachée au support de tête sans anesthésie et réduit le stress et l’anxiété pendant l’expérience proprement dite. Si cela n’est pas possible et que l’anesthésie n’interfère pas avec l’expérience, une dose d’induction d’un anesthésique inhalé (par exemple, de l’isoflurane à 2 % à un débit d’O2 de 1 à 2 L/min) peut être utilisée pour fixer rapidement la souris à la scène de tête.
   2. Une fois la souris fixée au support de tête et dans le tube de retenue, suivez les étapes 3.1.1 à 3.1.5.

4. Perfusion de traceurs fluorescents du LCR

1. Aiguë CM Cannulation
   1. Étant donné que le traceur était déjà chargé dans la canule avant d’être placé dans la citerne magna à l’étape 1.6, réglez la pompe à perfusion sur le débit et le volume souhaités. Les paradigmes de perfusion couramment utilisés sont de 5 à 10 μL à 1-2 μL/min, mais ces paramètres peuvent être ajustés en fonction de l’expérience particulière, ou de la taille et de l’âge de l’animal.
2. Canulation chronique de la CM
   1. Avant de commencer la séance d’imagerie, suivez les étapes 1.2 à 1.7 pour les expériences aiguës afin de préparer la ligne de perfusion pour administrer les traceurs.
   2. Une fois la ligne préparée, à l’aide d’une pince d’hémostat, coupez l’extrémité scellée de la canule CM chronique. Prenez l’aiguille de la ligne préparée à l’étape 4.2.1 et insérez-la doucement dans la canule. Relâchez la pince et, à l’aide du pousse-seringue, faites avancer le traceur de LCR au débit de perfusion souhaité (par exemple, 2 μL/min) pour l’expérience jusqu’à ce que le traceur atteigne l’aiguille implantée dans le CM.
      ATTENTION : Si l’aiguille transperce le tube lors de la connexion de la ligne, retirez l’aiguille, coupez le segment percé et répétez cette étape. Toute déchirure du tube PE10 provoquera une fuite et affectera les résultats de l’expérience.

5. Configuration de la session d’imagerie

1. Sur la base du traceur fluorescent infusé, déterminez la longueur d’onde d’excitation et le temps d’exposition pour chaque canal. Choisissez le temps d’exposition le plus court nécessaire pour visualiser le traceur afin de maximiser la résolution temporelle de l’imagerie time-lapse. Ce temps d’exposition sera utilisé pour toutes les expériences ultérieures visant à comparer le transport du LCR entre différents animaux.
   REMARQUE : Une astuce consiste à utiliser le traceur dans la ligne CM pour ajuster le temps d’exposition. Bien qu’il s’agisse d’une première approche utile, celle-ci doit être optimisée au fil du temps.
2. Choisissez la durée de l’expérience et les intervalles auxquels les images seront acquises. Les expériences durent normalement entre 30 et 60 minutes selon la phase du transport glymphatique qui vous intéresse. Des fréquences d’images de 1 image/min et plus rapides sont suffisantes pour la plupart des expériences.
3. Définissez le nom du fichier et le répertoire de sauvegarde.
4. Si l’imagerie doit être collectée en plus de l’acquisition simultanée d’autres variables (par exemple, électrocardiogramme, pression artérielle, électrophysiologie), le macroscope et la pompe peuvent être programmés pour être déclenchés à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données. Vérifiez que la fonction de déclenchement sur le macroscope est correcte avant de passer à l’étape suivante.

6. Expérience d’imagerie optique transcrânienne

1. Démarrez la perfusion du traceur et l’imagerie en même temps.
2. Vérifiez régulièrement la canule CM et le tube PE10 pour tout signe de fuite. S’il y a une fuite de traceur au niveau du CM, les résultats de cette expérience doivent être exclus.
   REMARQUE : Si le traceur commence à s’accumuler dans le cervelet et ne parcourt pas la voie glymphatique des artères cérébrales moyennes (ACM), il est probable que la canule CM ait été injectée dans le cervelet. Ces données ne doivent pas être incluses.
3. Pour les expériences aiguës, une fois l’expérience terminée, retirez la souris du microscope et vérifiez qu’elle est toujours correctement anesthésiée. Décapitez rapidement la souris et récoltez le tissu cérébral. Immersion - fixer le cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant la nuit à 4 °C.
   1. Pour les expériences chroniques, une fois l’imagerie terminée, retirez la ligne CM de la canule, rincez avec de l’aCSF stérile et refermez la canule CM avec un embout de cautérisation à haute température. Retirez la souris du support de tête et remettez-la dans sa cage. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’il ne soit plus nécessaire de passer d’autres images, puis suivez l’étape 6.3.

Résultats

Figure 1. Imagerie macroscopique transcrânienne. (A) Schéma de l’imagerie macroscopique mise en place. (B) Vue dorsale de la position de la plaque de tête sur le crâne. L’os interpariétal et les os...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.25 % Bupivacaïne HCl			Université de Rochester Vivarium
100 μL Seringue étanche au gaz Modèle 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Poudre	de ciment dentaireFisher Scientific	NC9991371
Carprofen			Université de Rochester Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS Appareil photo	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Head Plate	Université de Rochester	Aucun catalogue #	Fabriqué sur mesure à l’atelier d’usinage de l’Université de Rochester
Cautère à haute température	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Accelerator	Bob Smith Industries	BSI-151
Isoflurane - Fluriso	Vet One	502017	Université de Rochester Vivarium
Kétamine			Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue	Elmer’s Products, Inc	Pas de catalogue #, voir lien dans les commentaires	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Ruban chirurgical	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldéhyde	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polyéthylène .011 » x .024 » par pi., 100 pi. continu	Braintree Scientific	PE10 100 PI
Pompe 11 Elite Infusion uniquement Seringue double	Harvard Appareil	70-4501
PURALUBE VET OINTMENT	Dechra
Puritan PurSwab Bâtonnets de nettoyage à pointe de coton	Fisher Scientific	22-029-553
Recherche Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
Simple Head Holder Plate (pour souris)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Aiguilles à usage unique, BD Medical	VWR	BD305106
Tampons de préparation à l’alcool stériles	Fisher Scientific	22-363-750
LED accordable	PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine			Vivarium de l’Université de Rochester